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糖组学糖蛋白研究的常用工具和前沿技术  

2015-03-31 17:55:55|  分类: 特定 |  标签: |举报 |字号 订阅

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摘要:

  与其他“组学”研究相比,糖组学研究特别复杂,这愈发凸显了研究工具的重要性。从电泳到串联质谱,现在糖蛋白的分析工具越来越精良,人们对这些复杂分 子的理解也越来越深入。本文介绍了一些糖蛋白研究的常用工具和前沿技术,希望能帮你轻松走进糖蛋白的神秘世界。
       继基因组学和蛋白质组学之后,糖组学逐渐受到了人们的重视。糖组学关注的焦点是糖蛋白:

糖蛋白上以共价键连接着各种聚糖,这些聚糖参与了细胞的许多关键活动(例如信号传导和细胞粘附),有着重要的生物学和医学意义。举例来说,抗体上的聚糖“影响着抗体的生物活性、药代动力学和稳定性,”Janssen制药公司的科学主管T. Shantha Raju说。

    绝大部分糖蛋白可以分为两类,N-连接糖蛋白和O-连接糖蛋白。在N-连接糖蛋白中,糖链与蛋白的天冬酰胺残基(N-糖苷键)以共价键相连。而O-连接糖蛋白的糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基相连(O-糖苷键)。

    糖蛋白的聚糖成分非常多变,但其中的规则却鲜为人知。人们无法根据给定的糖基化位点,判断与之相连的聚糖种类。实际上,同一个糖基化位点在不同时间点可以连接不同结构的糖链。

    与其他“组学”研究相比,糖组学研究特别复杂,这愈发凸显了研究工具的重要性。从电泳到串联质谱,

    现在糖蛋白的分析工具越来越精良,人们对这些复杂分子的理解也越来越深入。本文介绍了一些糖蛋白研究的常用工具和前沿技术,希望能帮你轻松走进糖蛋白的神秘世界。

糖组学工具

    糖蛋白大多位于细胞表面,属于水溶性不好的膜蛋白。目前研究者们主要通过透析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化糖蛋白。

    Sigma-Aldrich公司的Robert Gates介绍,分析糖蛋白上的聚糖主要有两种途径:将糖链从蛋白骨架上释放出来,然后研究游离的聚糖;或者消化糖蛋白,生成糖肽以便进一步研究。

    糖链释放主要有酶释放和化学释放两种方法。酶法释放比较简单,条件也很温和,还能够为人们提供大量的信息,因此很受欢迎。N-糖肽酶F(PNGase F)就是释放N-糖链常用的一种酶。然而,目前还没有合适的酶来释放O-糖链,人们只能采用化学释放法。

    化学法主要是肼解法,这种方法对N-糖链和O-糖链均适用。但肼解法的反应条件比较剧烈,之后还需要复原处理,而且蛋白部分已经破坏,无法进行糖基化位点的相关研究。

    N-聚糖制备一直是一个低通量的过程。不过,ProZyme公司开发的GlykoPrep糖样品快速制备平台可以使通量大大提高。该产品使用安捷伦的AssayMAP小柱,可以在三个小时以内消化和回收多至192个样本。“在此之前,人们完成这一流程需要三到四天,”ProZyme公司的Justin Hyche说。


    释放出聚糖之后,一般需要给它们添加荧光标签,而这一过程要用到有毒的还原剂氰基硼氢化钠,QA-Bio 公司的创立者Mike Gibson说。为此,QA-Bio 公司开发了一种使用无毒害还原剂(甲基吡啶硼烷)的LudgerTag聚糖标记试剂盒。

    目前,微量糖链分析首选高效液相层析(HPLC)法,因为这种方法上样量少、灵敏度高、重现性好、速度快而且可实现自动化。对已标记的聚糖进行高效液相层析,可以获得独特的糖型glycoformGibson说。人们可以在此基础上获得聚糖的多种信息,例如通过数据比对确定聚糖所含的单糖量。

    凝集素(Lectins)是能够特异性结合糖链的天然蛋白,可以被用来富集某种糖蛋白/糖链,也可以检测聚糖是否含有某种特定结构。它们就像抗体一样,可以同时起到捕获和检测的作用,市面上有大量的凝集素产品可供选择。

    除此之外,还有一个常用的聚糖分析技术:通过外切糖苷酶实现的“测序”分析。这种酶能够特异性切割末端糖基,为人们揭示聚糖的单糖组成。你可以从各大供应商买到外切糖苷酶和相应的标准品,当然你也可以选择经过优化的试剂盒产品,例如QA-Bio公司CarboSeq?N试剂盒,以及ProZyme公司的FACE?N-Linked Oligosaccharide测序试剂盒。

    释放后的聚糖能够为人们提供丰富的信息,“你可以了解唾液酸化、岩藻糖基化的情况。还可以确定某种聚糖是属于高甘露糖型还是杂合型,”加州大学的Carlito Lebrilla教授说,他主要对分离的聚糖进行质谱分析。

糖蛋白组学工具

    为了确定聚糖的结合位点(糖基化位点),研究者们往往会先用蛋白酶将糖蛋白切割成为质谱可用的糖肽。N-聚糖的糖基化位点是一个保守序列比较容易分析,但O-聚糖就没有这样的序列。

    使用特异性的蛋白酶(如胰蛋白酶)能够“在特定位点获得非常好的异质性Lebrilla说,但是这种方法得到的结果并不全面,不能覆盖到所有的位点。另一方面,用非特异性蛋白酶(例如pronase Ecathepsin)能将蛋白切割成更小的片段,提供更好的覆盖度。但这又会让“质谱仪很难解读”,Lebrilla说。

    Lebrilla习惯把多孔石墨化碳柱(PGC)与质谱结合起来使用。“PGC可以帮你将同分异构体分开”,单靠质谱是做不到这一点的。他有时还会在此基础上增加一个维度的分析,比如离子迁移分离。

    New Hampshire大学的Vernon Reinhold指出,“全面测序只能通过串联质谱MSn实现”, 其他方法(HPLC-MSMS/MS)只能得到“一系列建立在推论上的结果”。

    在研究糖蛋白时,每次都从头分析结构显然是不现实的。为此,研究者们希望尽快建立起可供搜索的糖蛋白文库,以便在此基础上进行快速的鉴定。幸运的是,这个工作虽然艰巨但并非是天方夜谭。据估计,人体内的N-聚糖结构还不到五千种,其中约有一百种占到了总量的99%

Josh P. Roberts撰写/叶予编译)

来源:生物通
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