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Jackson二抗授权|蛋白|细胞因子

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等温滴定量热  

2017-01-16 17:22:07|  分类: 仪器耗材 |  标签: |举报 |字号 订阅

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        等温滴定量热技术(ITC)是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术,是一种测定生物分子反应热动态的主要技术。它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。 在单次实验中即可同时测定所有结合的热力学参数(n,KD,ΔH 和 ΔS)。可应用于检定蛋白、抗体、核酸、脂类和其他生物分子间的相互作用;先导药物的优化;酶促反应动力学以及分子结构修饰改变后的结合效果评估等。由于ITC 不仅仅可用于测定分子间的结合亲和力,更能详细的阐述分子间相互作用的机制,提供机构分析必须的热力学参数,因此该方法正越来越多的被应用于生物分子相互作用的研究。


仪器功能及参数
仪器功能及参数指标
(一)、主要功能包括:
       1、表征生物分子间的相互作用,包括确证结合及活性,测定化学计量比和热力学参数
      2、Hit验证及表征
      3、先导化合物的优化
      4、活性作用机制
、参数指标:
      1、短期噪音水平:0.5 ncal/s
      2、工作温度范围:2~80 ℃
      3、最小响应时间:10 s
      4、测量池材质:哈斯特镍碳合金
      5、测量池类型:硬币型,固定式
      6、测量池体积:200 ?L
      7、注射器:40 ?L,自动滴定
      8、最小准确滴定体积:0.1 ?L
操作流程
仪器操作流程、
(一)实验准备 
1、清洗仪器,包括样品池与滴定注射器;
清洗样品池:用 Cell water rinse 命令自动清洗;如果样品池比较脏,可使用5 - 20 %的去垢剂 Contrad 70(或 Decon 90)浸泡:使用 detergent soak and rinse 命令可自动完成。
清洗滴定注射器:用syringe wash 命令自动清洗同时清洗样品池和滴定注射器:用Cell and Syringe wash 命令 
2、样品准备,滴定与被滴定样品需要溶解在完全一致的缓冲液中,滴定 一次需要的样品量,样品池所需样品量200ul(建议准备300ul或以 上),浓度在25至100μM。注射器40ul(建议准备60ul或以上),浓度为样品池浓度的10至20倍左右。
(二)实验过程 
1、参比池中加入超纯水作为参照; 
2、样品池中加满样品,避免产生气泡; 
3、加完样品后,将上样针用缓冲液清洗干净; 
4、滴定注射器自动加样,避免产生气泡; 
5、设置实验参数,待参数稳定,进行滴定实验;   
在Advanced Experiment design 中设置滴定参数: 
Total Injections 代表滴定的次数 ,一般至少为 15滴 ;
Cell Temperature 中输入实验温度,范围:2 - 80 ?C,常设 25 度; 
Reference Power 设置系统补偿功率的大小,放热反应可以设 5 ?cal/s,较大的放热反应可设为 10 ?cal/s,吸热反应可设 2-3 ?cal/s。对于未知样品,建议选择 5 ?cal/s; 
Initial Delay 是正式开始滴定前的基线运行时间,通常选择 60 秒;
在 Syringe Concentration 中填入注射器中滴定物的浓度;
在 Cell Concentration 中填写样品池中被滴定物的浓度; 
Stirring Speed 指搅拌的转速,大部分iTC 实验请设为 1000 RPM;
在 Data File Name 中输入本次实验数据保存的文件名,后缀为.iTC文件名长度不要超过 16 个字符;
在 Feedback Mode 中选择功率反馈的模式,通常只选择 High 模式;
在Injection Parameter 部分设置每 1次滴定的参数。Volume 代表每次滴定样品的 体积,常为 2 到 3 ?l。Duration 是指注射的时间,默认值为体积数的 2 倍。Spacing 代表两次滴定间的间隔时间。Filter Period 指的是数据采集的频率,推荐设为 5 秒钟。 
Setup 窗口中设置数据保存的文件路径; 
Cell boot Temp 中设置系统的起始温度;    
使用同样的设置,用同样的样品滴定缓冲液用作空白对照。 
6. 清洗仪器,进行水滴水实验。
· 清洗样品池:可用 Cell water rinse 命令自动清洗,强烈推荐手动清洗样品池。如果样品池比较脏,可使用5 - 20 %的去垢剂 Contrad 70(或 Decon 90)浸泡,此时禁止用Cell water rinse 命令自动清洗,只能手动清洗。
· 清洗滴定注射器:用syringe wash 命令自动清洗
使用同样的实验设置,做水滴水实验(做水滴水实验运行“syringe fill”时必须仪器负责人或平台负责老师在场确保有水吸上来,否则水滴水实验结果无效),水滴水实验结束后通知仪器负责人或平台负责老师检验仪器是否清洗干净,合格后清理实验桌面可离开,否则继续清洗仪器直到水滴水实验达标后才可离开。
 
 
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